Diferença entre Gene Cloning e PCR | Gene Cloning vs PCR

Diferença-chave - Clonagem de genes vs PCR

A síntese de muitas cópias de DNA de um fragmento de DNA específico é chamada de amplificação de DNA. Existem dois processos principais de amplificação de DNA, nomeadamente a clonagem de genes e a PCR. A principal diferença entre a clonagem de genes e a PCR é a clonagem de genes produz as múltiplas cópias de um gene específico in vivo construindo um DNA recombinante e crescendo dentro de uma bactéria hospedeira enquanto a PCR produz milhões de cópias de um fragmento de DNA específico in vitro submetido a ciclos repetidos de desnaturação e síntese.

ÍNDICE

1. Visão geral e diferença de chave

2. O que é Gene Cloning

3. O que é PCR

4. Comparação lado a lado - Clonagem de genes versus PCR

5. Resumo

O que é Gene Cloning?

A clonagem de genes é uma técnica empregada para localizar e multiplicar um gene específico do DNA genômico extraído de um organismo através da construção de DNA recombinante. O DNA genômico contém milhares de genes diferentes codificados para proteínas. Quando o DNA é extraído, ele inclui todos os genes possíveis que pode suportar. A técnica de clonagem de genes permitiu a detecção de um gene específico a partir do DNA total. Portanto, a clonagem de genes serve como uma ferramenta importante na biologia molecular.

A criação de uma biblioteca genômica de um organismo é essencial na clonagem de genes se não houver nenhuma pista sobre a localização do gene relevante no DNA. Uma biblioteca genômica é feita usando as seguintes etapas.

Passo 1: Extração do DNA total de um organismo que contém o gene desejado.

Passo 2: Digitação de restrição do DNA extraído para produzir pequenos fragmentos gerenciáveis. Este passo é facilitado pelas endonucleases de restrição.

Passo 3: Selecção de um vector adequado e abertura do vector de ADN utilizando as mesmas endonucleases de restrição. Os plasmídeos bacterianos são comumente usados ​​como vetores para transportar DNA estranho. Os plasmídeos são pequenos círculos de DNA localizados dentro das bactérias.

Passo 4: Combinação do DNA vetorial e DNA fragmentado para produzir molécula de DNA recombinante. Este passo é regido pela DNA ligase.

Passo 5: Transferência de moléculas de DNA recombinante para bactérias hospedeiras. Este passo é conhecido como transformação, e é feito usando um choque térmico.

Passo 5: Triagem de células bacterianas transformadas em meio de cultura. Uma população mista de células hospedeiras transformadas e não transformadas é obtida no final do processo de transformação. Como o gene de interesse inclui apenas em células hospedeiras transformadas.Portanto, é necessário selecionar células transformadas. A seleção é feita usando meios seletivos que contêm antibióticos. Somente as células transformadas crescem neste meio de seleção permitindo a seleção.

Passo 6: Crescimento de bactérias para produzir uma biblioteca de genes. Neste passo, as células hospedeiras transformadas são introduzidas em meios de cultura frescos que proporcionam requisitos de crescimento ótimos. As colônias totais nas placas de cultura representam a biblioteca genômica desse organismo.

Passo 7: A molécula de ADN recombinante que contém o gene de interesse deve ser rastreada a partir de milhares de fragmentos clonados de ADN recombinante. Pode ser realizada pelo uso de sondas que marcam o gene específico ou a proteína específica resulta desse gene.

Uma vez que o gene interessado contendo a colônia bacteriana é identificado a partir das colônias totais, é possível fazer milhões de cópias do plasmídeo recombinante que contém o gene.

A clonagem de genes é usada no estabelecimento de bibliotecas de genes, produzindo genomas especiais de proteínas, vitaminas, antibióticos, hormônios, seqüenciamento e mapeamento dos organismos, fazendo cópias múltiplas de DNA de indivíduos em forenses, etc.

Figura_1: Clonagem de genes

O que é PCR?

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica que gera um grande número de cópias de um fragmento de DNA particular. A amplificação exponencial de uma sequência de DNA específica é obtida por PCR em condições in vitro. Esta técnica é uma ferramenta muito poderosa em Biologia Molecular, uma vez que pode multiplicar uma pequena amostra de DNA em uma quantidade utilizável. O PCR foi introduzido por Kary Mullis em 1983 e esta invenção premiada criou um enorme avanço na Biologia Molecular.

A técnica de PCR segue as reações repetidas de PCR como mostrado na Figura 02. Uma reação de PCR consiste em três etapas principais que ocorrem em três temperaturas diferentes; desnaturação de cadeia dupla em DNA a 94 ⁰ C, recozimento de primers a 68 ⁰ C e alongamento de cadeia a 72 ⁰ C. Portanto, quando a PCR é realizada, a flutuação da temperatura deve ser altamente mantida para a replicação adequada. O PCR é realizado em uma máquina de PCR dentro de tubos de PCR. Os tubos de PCR são carregados com misturas de PCR corretas contendo DNA modelo, Taq polimerase, primers, dNTPs e tampão. A desnaturação de DNA de amostra de cadeia dupla em DNA de cadeia simples é feita quebrando as ligações de hidrogênio entre bases complementares a 94 - 98 ⁰ C. Então, os fios simples do DNA modelo são expostos para iniciadores. Um par de primers (para frente e para trás) devem ser fornecidos, e eles devem ser termostáticos para tolerar altas temperaturas. Os primers são sequências de DNA curtas de cadeia simples complementares às extremidades do fragmento de DNA alvo. Primários sintéticos são utilizados na PCR. Os iniciadores se ligam com as bases complementares do DNA da amostra e iniciam a síntese de uma nova cadeia. Este passo é catalisado por uma enzima chamada Taq polimerase; uma enzima termostática de DNA polimerase isolada de Thermus auqaticus. Quando os iniciadores e os nucleotídeos (blocos de construção) estão disponíveis, a polimerase Taq constrói a nova cadeia de DNA complementar ao modelo de DNA.No final do programa de PCR, o fragmento de DNA amplificado é observado usando eletroforese em gel. Se for necessária uma análise adicional, o produto de PCR é purificado a partir do gel.

A PCR é muito útil para diagnosticar e monitorar doenças genéticas e adquiridas, identificação de criminosos (no campo da medicina forense), estudando a estrutura e função de um segmento segmentado de DNA, seqüenciamento e mapeamento de genomas de organismos, etc. O PCR tornou-se uma técnica de laboratório de rotina em laboratórios de pesquisa de biologia médica e molecular entre cientistas, uma vez que possui uma grande variedade de aplicações.

Figura_2: Reação em cadeia da polimerase

Qual a diferença entre a clonagem de genes e a PCR?

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Gene Cloning vs PCR
A clonagem de genes é o processo de fazer cópias múltiplas de um gene específico in vivo através de DNA recombinante e transformando-se em uma bactéria hospedeira.	A técnica de PCR produz múltiplas cópias de uma sequência de DNA particular in vitro através de ciclos repetidos de reações de PCR.
Requisito de Construir ADN Recombinante
O DNA recombinante é produzido para localizar o gene.	O DNA recombinante não é produzido.
Necessidade de trabalho
Este processo é intensivo em mão-de-obra.	Não é necessário trabalho intensivo.
Processo in vivo ou in vitro
A construção de DNA recombinante é in vitro e a amplificação do DNA é in vivo.	A amplificação do DNA ocorre completamente in vitro.

Resumo - Gene Cloning vs PCR

A clonagem de genes e a PCR são dois métodos utilizados para a amplificação do DNA. O PCR é um processo in vitro que faz cópias múltiplas de DNA de um determinado fragmento de DNA sem utilizar DNA recombinante e um organismo hospedeiro. A clonagem de genes é principalmente um processo in vivo que resulta em múltiplas cópias de um gene interessado dentro do organismo hospedeiro através da construção de DNA recombinante. Esta é a diferença entre a clonagem de genes e a PCR.

Referência:

1. Griffiths, Anthony JF. "Clonando um gene específico. "Análise Genética Moderna". U. S. Biblioteca Nacional de Medicina, 01 de janeiro de 1999. Web. 22 de fevereiro de 2017

2. "Reação em cadeia da polimerase (PCR). "Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia". U. S. Biblioteca Nacional de Medicina, n. d. Rede. 22 de fevereiro de 2017

Cortesia da imagem:

1. "Figura 17 01 06" Por CNX OpenStax - (CC BY 4. 0) via Commons Wikimedia

2. "PCR" Por Madprime - Trabalho próprio (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia