Diferença entre Sanger Sequencing and Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Diferença-chave - Secagem de Sanger vs Pirosequencing
A seqüência de DNA é muito importante para a análise de DNA desde o conhecimento do arranjo de nucleotídeos correto em uma região de DNA particular revela muitas informações importantes sobre isso. Existem diferentes métodos de seqüenciamento de DNA. Sanger sequencing e Pyrosequencing são dois métodos diferentes de sequenciação de DNA amplamente utilizados em Biologia Molecular. A principal diferença entre Sanger sequencing e Pyrosequencing é que Sanger seqüenciamento usa didesoxinucleótidos para terminar a síntese de DNA para ler a sequência de nucleotídeos, enquanto a pirosequenciamento detecta a liberação de pirofosfato incorporando os nucleotídeos e sintetizando a sequência complementar para ler a ordem precisa da seqüência.
ÍNDICE
1. Visão geral e diferença de chave
2. O que é Sanger Sequencing
3. O que é Pyrosequencing
4. Comparação lado a lado - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Resumo
O que é Sanger Sequencing?
O seqüenciamento de Sanger é um método de seqüenciamento de DNA de primeira geração desenvolvido por Frederick Sanger e suas faculdades em 1977. Também é conhecido como Sequenciamento de Terminação de Cadeia ou Seqüência de Didesox uma vez que se baseia em terminação da cadeia por didesoxinucleótidos (ddNTPs). Este método foi amplamente utilizado por mais de 30 anos até a Seqüência de Nova Geração (NGS) foi desenvolvida. A técnica de seqüência de Sanger permitiu a descoberta da ordem de nucleotídeo correta ou a fixação de um fragmento de DNA particular. Baseia-se na incorporação seletiva de ddNTPs e na terminação da síntese de DNA durante a replicação do DNA in vitro. A ausência de grupos 3 'OH para continuar a formação de ligações fosfodiéster entre nucleótidos adjacentes é uma característica única de ddNTPs. Assim, uma vez que o ddNTP está ligado, o alongamento da corrente cessa e termina a partir desse ponto. Há quatro ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP - usados na seqüência de Sanger. Esses nucleotídeos interrompem o processo de replicação de DNA quando são incorporados na cadeia crescente de DNA e resultam em diferentes comprimentos de DNA curto. A eletroforese em gel capilar é usada para organizar esses pequenos fios de DNA pelos seus tamanhos em um gel como mostrado na Figura 01.
Figura 1: eletroforese em gel capilar de DNA curto sintetizado
Para in vitro replicação de DNA, poucos requisitos devem ser fornecidos. Eles são DNA polymerase enzyme, template DNA, oligonucleotídeo primers, e desoxynucleotides (dNTPs). Na seqüência de Sanger, a replicação do DNA é realizada em quatro tubos de ensaio separados, juntamente com quatro tipos de ddNTPs separadamente. Os desoxinucleótidos não são totalmente substituídos pelos respectivos ddNTPs. Uma mistura do dNTP particular (por exemplo, dATP + ddATP) está incluída no tubo e replicada. Quatro produtos de tubo separados são executados em um gel em quatro poços separados. Então, lendo o gel, a seqüência pode ser construída como mostrado na Figura 02.
Figura 02: sequenciação de Sanger
A seqüência de Sanger é uma técnica importante que ajuda em muitas áreas de biologia molecular. O projeto do genoma humano foi concluído com sucesso com a ajuda de métodos baseados em sequenciação de Sanger. O seqüenciamento de Sanger também é útil na seqüenciamento de DNA-alvo, câncer e pesquisa de doenças genéticas, análise de expressão gênica, identificação humana, detecção de patógenos, seqüenciamento microbiano, etc.
Existem várias desvantagens da seqüenciamento de Sanger:
- O comprimento do DNA sendo sequenciado não pode ser superior a 1000 pares de bases
- Apenas uma cadeia pode ser sequenciada de cada vez.
- O processo é demorado e caro.
Portanto, novas técnicas avançadas de seqüenciamento foram desenvolvidas com o tempo para superar esses problemas. No entanto, o seqüenciamento do Sanger ainda está em uso devido aos seus resultados altamente precisos até aproximadamente fragmentos de comprimento de aproximadamente 850 pares de bases.
O que é Pyrosequencing?
Pyrosequencing é uma nova técnica de seqüenciamento de DNA baseada no "seqüenciamento por síntese". Esta técnica baseia-se na detecção da libertação de pirofosfato após a incorporação de nucleótidos. O processo é empregado por quatro enzimas diferentes: polímero de DNA, ATP sulfilase, luciferase e apirase e dois substratos adenosina 5 'fosforosulfato (APS) e luciferina.
O processo começa com a ligação do iniciador com o modelo de ADN de cadeia simples e DNA polimerase inicia a incorporação de nucleótidos complementares. Quando os nucleótidos se juntam (polimerização de ácido nucleico), ele libera grupos de pirofosfato (dois grupos de fosfatos ligados) e energia. Cada adição de nucleotídeo libera quantidade equimolar de pirofosfato. O pirofosfato converte-se em ATP por ATP sulfilase na presença de substrato APS. O ATP gerado conduz a conversão mediada por luciferase de luciferina para oxiluciferina, produzindo luz visível em quantidades que são proporcionais à quantidade de ATPs. A luz é detectada por um dispositivo de detecção de fótons ou por fotomultiplicador e cria um pirograma. Apyrase degrada ATP e dNTPs não incorporados na mistura de reação. A adição de dNTP é feita uma vez por vez. Uma vez que a adição de nucleótido é conhecida de acordo com a incorporação e detecção de luz, a sequência do modelo pode ser determinada.Pyrogram é usado para gerar a sequência de nucleotídeos do DNA da amostra, como mostrado na Figura 03.
A redução de Pyrose é muito importante na análise de polimorfismo de nucleotídeo único e no seqüenciamento de pequenos trechos de DNA. A alta precisão, flexibilidade, facilidade de automação e processamento paralelo são as vantagens da pirosequenciamento em técnicas de sequenciação de Sanger.
Figura 03: Pirosequencing
Qual a diferença entre Sanger Sequencing e Pyrosequencing?
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Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
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| Sanger seqüenciamento é um método de seqüenciamento de DNA baseado na incorporação seletiva de ddNTPs por DNA polimerase e terminação da cadeia. | Pyrosequencing é um método de sequenciação de DNA baseado na detecção de liberação de pirofosfato após a incorporação de nucleotídeos. |
| O uso de ddNTP | |
| ddNTPs são usados para terminar a replicação de DNA | ddNTPs não são usados. |
| Enzimas envolvidas | |
| DNA polimerase são utilizadas. | São utilizadas quatro enzimas: DNA polimerase, ATP sulfilase, Luciferase e Apirase. |
| Substratos Usados | |
| APS e Luciferin não são usados. | O fosfosulfato de adenosina 5 '(APS) e a luciferina são utilizados. |
| Temperatura máxima | |
| Este é um processo lento. | Este é um processo rápido. |
Resumo - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sequencing e Pyrosequencing são dois métodos de sequenciação de DNA utilizados na biologia molecular. A seqüência de Sanger constrói a ordem dos nucleótidos em sequência, encerrando o alongamento da cadeia enquanto a pirosequencing constrói a ordem precisa dos nucleótidos em sequência por incorporação de nucleótidos e detecta a liberação de pirofosfatos. Portanto, a principal diferença entre Sanger sequencing e Pyrosequencing é que a seqüência de Sanger funciona no seqüenciamento por terminação da cadeia, enquanto a pirosequenciamento funciona no seqüenciamento por síntese.
Referência:
1. Fakruddin, Md e Abhijit Chowdhury. "Pirosequenciamento - uma alternativa à seqüenciamento tradicional de Sanger. "American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Publicações da Ciência, 02 de março de 2012. Web. 28 de fevereiro de 2017.
2. "Sequência de Sanger. "Seqüenciamento de Sanger - ScienceDirect Topics. N. p., n. d. Rede. 28 de fevereiro de 2017
Cortesia da imagem:
1. "Didesoxy-Methode" Por Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Por Enzo na língua polaca Wikipedia (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" por microbiologybytes (CC BY-SA 2. 0) através do Flickr
